L’exploration du métabolisme des acides aminés - PowerPoint Presentation

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L’exploration du métabolisme des acides aminés

4 eme année pharmacie

Dr

Morsli.M

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Plan

IntroductionStructure des acides amines Métabolisme des acides aminés

Les pathologies du métabolisme des acides amines

Exploration des pathologies du métabolisme des acides amines

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Introduction

Les acides amines constituent avec les glucides et les lipides les briques constitutives de la celluleIls proviennent essentiellement de la dégradation des protéines alimentaires ainsi que des protéines endogènes ou bien d’une synthèse de novo

acides amines

Protéines endogènes

Protéines alimentaires

Synthèse de novo

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Introduction

La structure des acides amines leur procure des propriétés physico-chimique qui seront utiles pour leurs mise en évidence pour le diagnostic des aminoacidopathies

, qui sont des pathologies dues à des déficits enzymatiques des voies du métabolisme des acides amines

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structure des acides amines

Les acides amines sont des molécules qui possèdent : une fonction acide carboxylique

Une fonction amine primaire

Une chaine latérale R

COOH

Cette structure leur procure des propriétés physico-chimiques qui sont exploitées pour leur mise en évidence, ils existent des réactions communes à tous les AA qui sont dues au groupement carboxyle et amine, et des réactions spécifiques qui sont dues à la chaine latérale R

CH

R

NH3

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métabolisme des acides amines

le métabolisme des AA comprend un métabolisme commun a tous qui concerne la fonction amine et la fonction carboxyle , et un métabolisme propre a chaque AA et qui concerne la chaine latérale R

Métabolisme

catabolisme

anabolisme

Synthèse à partir d’intermédiaires métaboliques

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catabolisme

NH3

COOH

R

Décarboxylation

Molécules d’intérêt biologiques

Transamination

D

ésamination

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Le catabolisme de l’azote amine

NH3

D

ésamination

Transamination

Oxydative

Non oxydative

Uréogenèse hépatique

Ammoniogenèse rénale

4/5

1

/5

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La transamination

Réaction de transfert réversible de groupement aminé entre un acide aminé et un corps α

cétonique, la réaction est catalysée par une aminotransférase qui utilise le phosphate de pyridoxal comme cofacteur

L’un des couples est toujours le glutamate/

α

cétoglutarate

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Exp : l’alanine aminotransferase

ALANINE NH3 α Cétoglutarate

PLP

PYRUVATE GLUTAMATE

NH3

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La désamination

Réaction d’élimination du groupement aminé qui transforme l’acide aminé en son corps

α

cétonique ,la réaction est catalysée par une désaminase

La désamination oxydative:

Catalysée par une glutamate déshydrogénase

GLUTAMATE

α

CéTOGLUTARATE +

NH3

La désamination non oxydative:

Catalysée par une déshydratase , elle concerne les AA suivants:SERINE PYRUVATE +

NH3

THREONINE CETOBUTYRATE + NH3

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La double transamination

La première transamination:Elle est spécifique à l’AA:

AA

NH3

α

CETOGLUTARATE

AC

α CETONIQUE GLUTAMATE

NH3

La deuxième transamination :GLUTAMATE

NH3 pyruvate α

CETOGLUTARATE alanine NH3

GLUTAMATE NH3

OXALOACETATE α CETOGLUTARATE ASPARTATE

NH3

ALAT

ASAT

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La transdésamination

La transamination: catalysée par une aminotransférase

AA

NH3

α

CETOGLUTARATE

AC

α

CETONIQUE GLUTAMATE NH3

La désamination : catalysée par une glutamate déshydrogénase

GLUTAMATE α CéTOGLUTARATE +

NH3

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L’ammoniogenèse

Le NH3 issu de la transdésamination , réagit dans le muscle avec le glutamate pour la synthèse de glutamine, réaction catalysée par la glutamine synthétase

NH3

+glutamate

NH3

glutamine (

2 NH3

)

La glutamine part à destination du rein pour subir 2 désaminations successives catalysée par une glutaminase, et libère le NH4+ qui sera éliminé dans les urines

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L’uréogenèse

NH3+ HCO3-

Carbamoyl phosphate

citrulline

argininosuccinate

arginine

ornithine

asparate

fumarate

urée

1

2

3

4

5

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1

Carbamoyl phosphate synthétase2

Ornithine transcarbamylase

3

Argininosuccinate synthétase

4

Argininosuccinase

5

Arginase

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Les pathologies du métabolisme des acides amines

Ce sont des maladies héréditaires qui se transmettent selon le mode autosomique récessif , elles sont dues à des mutations des gènes qui codent pour les enzymes des voies du métabolisme des acides amines

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I . Les déficits génétique du cycle de l’urée

Certaines anomalies congénitales portent sur l’une des enzymes impliquées dans la formation de l’urée , ce qui a pour conséquences une hyperammoniémie car l’uréogenèse est la voie principale d’ élimination du NH3 sous forme d’urée

les symptômes qui se manifestent sont causés par la toxicité de l’ammoniac pour le système nerveux central , il s’agit de nausées , vomissement , trouble du tonus et coma

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Les déficits génétique du cycle de l’urée

PATHOLOGIE

ENZYME DEFICIENTE

SYMPTOMES

HYPERAMMONIEMIE

TYPE I

CARBAMOYL PHOSPHATE SYNTHETASE

LETHARGIE,CONVULSION, MORT

HYPERAMMONIEMIE TYPE IIORNITHINE TRANSCARBAMYLASELETHARGIE,CONVULSION, MORT

ACIDEMIE ARGININOSUCCINIQUE

ARGININOSUCCINASEVOMISSEMENT, CONVULSIONARGININEMIE

ARGINASERETARD MENTAL

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L’uréogenèse

NH3+ HCO3-

Carbamoyl phosphate

citrulline

argininosuccinate

arginine

ornithine

asparate

fumarate

urée

1

2

3

4

5

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II . Les phénylcétonuries

Définition et incidence:

C’est une maladie génétique héréditaire qui se transmet selon le mode autosomique récessif , c’est la plus fréquente des maladies héréditaire du métabolisme des AA ( 1/10000 )

Elle est due à un déficit en

phénylalanine hydroxylase

PAH, ou plus rarement à son cofacteur la tetrahydrobioptérine THB par déficit de la

dihydrobioptérine réductase

,l’enzyme qui permet la régénération de THB

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PHENYLALANINE

TYROSINE

PAH

THB

DHB

DHB REDUCTASE

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b) Clinique:

L’enfant est normal à la naissance , des signes autistiques apparaissent au 6eme mois qui se développent en retard mental due à l’action toxique de la phy sur la myélinisation des nerfs Une hypothyroidie par hypotyrosinémie

Une hypo pigmentation par déficit en mélanine

PHENYLALANINE

TYROSINE

MELANINE

THYROXINE

CATECHOLAMINE

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c) Biologie:

Le déficit en PAH entraine une accumulation de la phy dans le sang , ce qui entraine l’activation d’une voie mineur dans les conditions physiologique qui synthétise les corps cétoniques de la phy qui sont éliminés dans les urines d’où le nom phenylcétonurie

PHENYLALANINE

PHENYLPYRUVATE

PHENYLACETATE

PHENYLLACTATE

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D) Traitement:

Il s’agit d’un régime pauvre en phy, car cette AA reste essentielle à l’organismeUne concentration élevée en phy chez la femme enceinte phenylcétonurique peut provoquer des anomalies du développement du fœtus

Dans les pays développés le dépistage de la PCU est systématique à la naissance

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III Les erreurs innées du métabolisme de la tyrosine

TYROSINE

4-OH PHENYLPYRUVATE

HOMOGENTISATE

MALEYLACETOACETATE

FUMAR

YLACETOACETATE

FUMARA

TE

ACETOACETATE

TYROSINEMIE II

TYROSINEMIE III

TYROSINEMIE I

ALCAPTONURIE

TYROSINE AMINOTRANSFERASE

4OH PHENYLPYRUVATE OXYGENASE

HOMOGENTISATE OXYGENASE

FUMARYL ACETOACETASE

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La tyrosinémie type I:

Due à un déficit en fumarylacetoacetase, ce qui provoque l’accumulation de fumarylacetoacetate qui est à l’origine d’atteintes hépatiques conduisant à des cirrhose , et d’atteintes tubulaires conduisant au syndrome de Fanconi La tyrosinémie type II:

Due à un déficit en tyrosine aminotransferase

,

peut affecter les yeux, la peau et le développement mental. Les premiers symptômes sont le larmoiement excessif, la douleur oculaire et l'apparition d'ulcères à la corné. Une déficience intellectuelle est notée sur 50 % des personnes atteintes.

La tyrosinémie typeIII:

Due à un déficit en 4 OH phenylpyruvate dioxygenase. Elle cause des convulsions, une déficience intellectuelle et, de façon intermittente, une absence de coordination des membres (ataxie).

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L’alcaptonurie:

Due à un déficit en homogentisate dioxygenase qui provoque l’accumulation d’acide homogentisique donnant à la peau une coloration brunâtre, c’est une affection bénigne L’acide homogentisique est incolore mais s’oxyde à l’air libre donnant une coloration brunâtre aux urines

L’albinisme:

Due à un déficit en tyrosinase , l’enzyme qui permet la synthèse de mélanine à partir de tyrosine ce qui induit une perte de pigmentation ( cheveux blanc , peau rose )

TYROSINE

MELANINE

TYROSINASE

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IV La leucinose:

C’est un déficit enzymatique en déshydrogénase des corps cétoniques des acides amines à chaine ramifiée, ce qui provoque l’accumulation de valine, leucine et isoleucine qui seront éliminés dans les urines et lui confèrent une odeur de sirop d’érable

Les signes cliniques sont des vomissements, convulsion et mort précoce

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V. Les hyperhomocysteinémies

Maladie héréditaire transmise selon le mode autosomique récessif, elle est due à un trouble enzymatique du métabolisme de la méthionine .Le défaut enzymatique porte sur la

cystathionine

-synthéase.

METHIONINE

HOMOCYSTEINE

CYSTATHIONINE

cystathionine

-synthéase

.

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Le taux d'

homocysteine sanguin est très augmenté (100 micromole / L au lieu de 10 micromole normalement).

Cette

hyperhomocysteinémie

est responsable d

’

accidents vasculaires, thromboemboliques ou plus rarement d’athérosclérose. L’

homocystéine

a un rôle délétère sur l’endothélium vasculaire, et stimulent la production des médiateurs de l’inflammation

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Tab :les maladies génétiques affectant le métabolisme des acides aminés

LES

PATHOLOGIES

ENZYME DEFICIENTE

SYMPTOMES

BIOLOGIE

HYPERAMMONIEMIE

TYPE ICARBAMOYL PHOSPHATE SYNTHETASE

LETHARGIE,CONVULSION, MORT AMMONIUM

HYPERAMMONIEMIE TYPE IIORNITHINE TRANSCARBAMYLASE

LETHARGIE,CONVULSION, MORT AMMONIUMACIDEMIE ARGININOSUCCINIQUE

ARGININOSUCCINASEVOMISSEMENT,

CONVULSION AMMONIUM , ARGININOSUCCINATE

ARGININEMIEARGINASERETARD MENTAL

AMMONIUM, ARGININEPHENYLCETONURIEPHY HYDROXYLASEDHB REDUCTASE

RETARD MENTAL,

HYPOPIGMENTATION

PHY,

PHENYLACETATE, PHENYLLACTATE, TYROSINE

TYROSINEMIE

I

FUMARYLACETOACETASE

ATTEINTES

HEPATIQUE ET TUBULAIRE

FUMARYLACETOACETATE

ET MALEYLACETOACETATE

ALCAPTONURIE

HOMOGENTISATE DIOXYGENASE

PIGMENTS NOIR SUR LA PEAU

HOMOGENTISATE

LEUCINOSE

DESHYDROGENASE

DES CORPS CETONIQUES DES AA RAMIFIEE

CONVULSION

LEUCINE,VALINE

ET ISOLEUCINE

HYPERHOMOCYSTEINEMIE

CYSTATHIONINE SYNTHETASE

ACCIDENTS THROMBOEMBOLIQUES

HOMOCYSTEINE SANGUIN ET URINAIRE

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Exploration des pathologies du métabolisme des acides amines

L’exploration repose sur la structure chimique des acides aminés qui procure une réactivité aux différents groupements fonctionnelles et permet leurs séparation , identification et quantification dans un milieu biologique

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EXPLORATION

DEPISTAGE

QUANTIFICATION

DOSAGE SPECIFIQUE

FRACTIONNEMENT

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I. Techniques de dépistage:

Ce sont des réactions qui permettent de détecter rapidement une concentration anormale en AA ou en leur catabolites, elles se font sur les urines fraiches du matin

Réaction de BRAND

: permet de mettre en évidence les AA soufrés comme la cysteine et l’homocysteine, qui développent une coloration rouge avec le nitroprussiate de sodium en milieu alcalin

Le 2,4 dinitrophenylhydrazine DNPH

en milieu chlorhydrique donne avec les acides cétoniques un précipité jaune d’hydrazone

Le perchlorure de fer fecl 3

en milieu acide donne une coloration variable selon le dérivé

PHENYLPYRUVATE

VERT ± FUGACE

TYROSINE ET DERIVE

VERT FUGACE

DERIVE DE L’HISTIDINE BLEU VERT STABLE

DERIVE DE LA LEUCINE BLEU

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4)

Les ions mercuriques :En présence de nitrites , la tyrosine et ses métabolites donnent un composé rouge violacée

NB:

Le dépistage permet d’orienter le diagnostic

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II. Techniques de quantification des acides amines

Réaction à la ninhydrine

:

Les AA en présence de ninhydrine,à chaud et en milieu tamponné à Ph 5,5 forment un composé violacé appelé pourpre de

ruhemann

dont l’absorbance est mesuré à 570nm

Avec la proline qui est un iminoacide ont obtient une coloration jaune qui absorbe à 440nm

Réaction à la fluorescamine:

La fluorescamine réagit rapidement avec les AA dans un tampon borate PH9 et permet d’obtenir un dérivé fluorescent très sensible qui détecte des concentration de l’ordre du nano gramme

Le chlorure de dansyle

:

Il forme avec les AA un dansylaminoacide

fluorescent Le 1 fluoro 2,4

dinitrobenzene DNFB ( réaction

de Sanger )

À ph 9 les AA forment avec le DNFB le dinitrophenylaminoacide coloré en jaune qui absorbe à 420 nm Rmq:

Ces réactifs réagissent avec le groupement

α

aminé des AA

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III. Technique de fractionnement des acides amines

Chromatographie sur couche mince:

Cette technique permet la séparation des AA entre 2 phases:

Phase stationnaire :la couche de gel en silice ou cellulose

Phase mobile: un solvant qui est un mélange de butanol, d’acide acétique et d’eau

Après migration des AA sur le gel , la révélation se fait à la ninhydrine, on peut identifier l’acide aminé grâce à la comparaison avec des témoins qui sont des standards d’acides aminés

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III. Techniques de fractionnement des acides amines

Electrophorèse sur papier:

Les AA soumis à un tampon acide acquirent une charge qui dépend du groupement fonctionnelle R, cette différence de charge permet leurs séparation par migration lorsqu'ils sont soumis à un champ électrique

Electrochromatographie:

C’est un couplage entre électrophorèse dans une première étape, et une chromatographie dans une étape ultérieur

Cette technique a un excellent pouvoir de résolution

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IV. Techniques de dosage spécifique

Méthodes chromatographiques

Méthodes

microbiolo

giques

Méthodes chi

m

iques

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a) Méthodes chromatographiques :

La chromatographie échangeuse d’ions:

C’est une technique qui permet la séparation, l’identification et la quantification de chaque AA dans un liquide biologique

La colonne de chromatographie est formé d’un tube remplie de particules synthétiques chargées , ceux avec groupements anioniques sont appelés résines échangeuses de cations et ceux qui possèdent des groupements cationiques sont appelés résines échangeuses d’anions

Les AA seront élués en fonction de leur affinité pour la résine

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Exp: colonne échangeuse de cations

Des groupements anioniques sont fixés sur la résine SO3- qui attire les AA chargés positivementLa solution d’acide aminé est amené à ph 3, à ce ph tous les AA sont chargés positivement, cette charge diffère par le radical R

Les AA ayant la charge la plus positive se lie solidement à la résine et migrent plus lentement ,ceux ayant la charge la moins positive migrent rapidement et seront élués les premiers.

Chaque fraction recueillie à la sortie de la colonne est quantifiées par la réaction à la ninhydrine

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a)Méthodes chromatographiques

La chromatographie liquide haute performance HPLC : C’est une chromatographie à haute pression , la pression permet une séparation en un temps plus court avec une meilleur résolution, l’élution, la collection et l’analyse des fractions sont automatisés , le résultat est un chromatographe qui donne la nature de l’AA par le temps de rétention et sa concentration par la surface du pic . C’est la technique de référence pour l’étude des AA

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b) Méthodes microbiologiques:

Test de Guthrie:La phenylalanine est un facteur essentiel à la croissance de certaines souches de Bacillus subtilus

On additionne à une gélose le B2 thyenylalanine ,c’est un antagoniste de la phy qui inhibe la croissance bactérienne

On étale sur la gélose une suspension de la bactérie et on pose un disque de papier imprégné de sang , si la concentration de la phy dépasse 120 umol/l on aura une croissance bactérienne , la zone de croissance est comparée avec celle obtenues à l’aide de disques témoins

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c) Méthodes chimiques:

Ces méthodes permettent de doser spécifiquement des AA ou des produits de leur métabolisme

Dosage de la

phenylalanine

:

réaction de

McCaman

et Robins

En présence d’un dipeptide L-

leucyl

-L-alanine, la PHY forme un complexe fluorescent avec la ninhydrine

-CuDosage de la tyrosine:

Le 1 nitroso

2 naphtol et le nitrite forment en solution d’acide nitrique avec la tyrosine un complexe fluorescent

Dosage de l’ammoniac:α

Cetoglutarate+NADH,H +NH3 NAD+glutamateOn mesure la diminution de l’absorbance du NADH,H à 340 nm

Glutamate déshydrogénase

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AMINOACIDES

ET DERIVES CONCENTRATION PLASMATIQUE µmol/l

ORNITHINE

45 -

190

ARGININE

20 - 140

VALINE

90 - 290

LEUCINE 70 - 155 ISOLEUCINE

35 - 85 PHENYLALANINE

30 - 70 TYROSINE 25 - 90

Concentrations plasmatiques des acides amines et dérivés