promotor RBSadaptor teminator を PCR で増やす 2 GFP lacI araC のパーツを PCR で 増やす 2 promotorRBSadaptorteminator をプラスミドの中に入れる ID: 788571
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Slide1
araC_lacI oscillator
1-1.
promotor
- RBS-adaptor-
teminator
を
PCR
で増やす
-
2. GFP
、
lacI
、
araC
のパーツを
PCR
で
増やす
2.
promotor+RBS+adaptor+teminator
をプラスミドの中に入れる
3.
araC
、
GFP
、
lacI
の
ORF
を
HindIII
で入れる
4.
araC
と
GFP
をつなぐ
5.
araC_GFP
、
lacI
を同時に大腸菌に入れる
Slide2Step1-1. promotor
- RBS-adaptor-
teminatorをPCRで増やす
EcoRI
XbaI
ParaC/lacI
Adaptor(
パーツ以外の制限酵素部位、
HindIII
)
5’
3’
B0010
B0012
Primer
として注文
P1.1H
方法
:
PCRで増やす
必要なもの:*注文したprimer*P1.1H
speI
pstI
Adaprtor
の
部位はbackboneに切れる場所がない酵素を選ぶ(検討中)
RBS
HindIII
は
promotor
に切れる場所があるので、直す
Slide3Primer
EcoRI
XbaI
ParaC/lacI
Adaptor(
パーツ以外の制限酵素部位、
HindIII
)
配列
TCTAGA
AGATCT
GAATTC
CTTAAG
Terminator
の最初の部分
ccaggcatcaaataaaacg
5’
側
5’
3
’
BBa_B0010
AAGCTT
TTCGAA
5’
3
’
RBS
attaaagaggagaaa
catagcatttttatccataagattagcggatcctaagc
aa
tacaattgtgagcgctcacaattatgatagattcaattgtgagcggataacaatttcaca
Slide4speI
pstI
3
’
側
3
’
5’
Teminator
の最後の部分
配列
TCTAGA
AGATCT
GAATTC
CTTAAG
gggcctttctgcgtttata
の
antisenseBBa_B0012
Primer注文
Slide5Step1-2. GFP
、
lacI
、
araCのパーツ
を
PCR
で増やす
HindIII
5’
3’
方法:
PCRで増やす
必要なもの:*注文したprimer*パーツ
#GFP(P1.2B) #lacI(P1.7L
、P1.2Oのどちらか) #araC(P1.14L)
HindIII
パーツの
ORF
ssrA tag
Slide6HindIII
5’
3
’
ORF
の最初の部分
primer
5’
側
配列
AAGCTT
TTCGAA
AAGCTT
TTCGAA
AAGCTT
TTCGAA
GFP
lacI
araC
Atggtgagcaagggcgagg
P1.2B
Atggtgaatgtgaaaccagtaacg
P1.2O/7L
Atggctgaagcgcaaaatgatcc
P1.14L
5’
5’
5’
3
’
3
’
3
’
Slide7HindIII
5’
3
’
ORF
の最後の部分
Primer(
続き
)
3’側配列
AAGCTT
TTCGAA
AAGCTT
TTCGAA
AAGCTT
TTCGAA
GFP
lacI
araC
Ggatgaactatacaaataataa
の
antisense
P1.2B
G
ctggcacgacaggtttcc
のantisenseP1.2O/7LGccgtcaagttgtcagctの
antisenseP1.14L
5’
5’
5’
3
’
3
’
3
’
ssrA
tag
Acgcgtgcaaacgacgaaaactacgctttagcagcttaacgcgt
の
antisense
同上
(
ssrA
tag
の
antisense)
同上
(
ssrA
tag
の
antisense)
Slide8Step2.
promotor+RBS+adaptor+teminator
をプラスミドの中に入れる
方法:パーツの制限酵素で切って貼る。
必要なもの:
Plasmid backbone*ColEI(P1.3D)*p15A(P1.9CとP1.9G
、同じものだけどQualityに不安があるのでどちらもやる)
ぷちっ
☆
Slide9Step3. araC
、
GFP、lacIのORF
をHindIIIで入れる
araC
とGFPはColEI、
lacIはp15Aに入れます
。間違わないように！！
よいしょ
☆
Slide10Step4. araC
と
GFPをつなぐ
araCとGFPをつないで、１つのプラスミドに入れる
Slide11Step5. araC_GFP
、
lacIを同時に大腸菌に入れる
うまくいけば振動する。。。