1 Coloration de Gram Divise les bactéries en deux groupes en fonction de la composition de la paroi cellulaire Gram Negatives amp Gram Positives 2 Rouge Mauve Coloration de Gram Principe ID: 757367
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Slide1
Microscopie
Colorations Différentielles
1Slide2
Coloration de Gram
Divise les bactéries en deux groupes en fonction de la composition de la paroi cellulaire
Gram Negatives & Gram Positives
2
Rouge MauveSlide3
Coloration de Gram - Principe
Utilise une combinaison de deux colorants
Coloration primaire - Cristal violet
Mauve
Coloration secondaire – Safranine
RougeGram positifLa paroi permet de piéger le 1er colorant
Gram négatifLa paroi ne permet pas de piéger le 1er colorant
3Slide4
Paroi Cellulaire
4Slide5
Méthode - Coloration Primaire
5
Coloration avec
cristal
violet
Ajout
de
l’
iode
de Gram
(Mordant)
+
Gram
positive
Gram
négative
- - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - -
LPS
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Membrane plasmique
Paroi: peptidoglycanSlide6
Méthode –
Étape Différentielle
6
Lavage à
l’alcool
Gram
positive
Gram n
égative
- - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - -
LPS
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Paroi est déshydraté et moins perméable
–
Complexe colorant + iode est piégé
Couche
LPS
est dissoute
Paroi est déshydraté, mais perméable
–
Complexe n’est pas piégé
Membrane plasmique
Paoi
: peptidoglycanSlide7
Méthode –
Contre Coloration
7
Coloration avec la
Safranine
Gram
positive
Gram
n
egative
- - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - -
LPS
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Membrane plasmique
Paoi
: peptidoglycanSlide8
Sommaire
8
Fixation
Coloration primaire
Cristal violet
Contre coloration
Safranine
Lavage
DécolorationSlide9
Gram Positif
Colorées Mauves
G + C faible
Bacille ou bâtonnet
Sporulants
: Genres Bacillus et ClostridiumNon sporulants
: Lactobacillus et ListeriaCoccus ou sphèreGenres Streptococcus, Staphylococcus et
Micrococcus
9Slide10
Gram Négatif
Colorées Rouges
Protéobactéries, Bactéroïdes, Chlamydia, Spirochètes, Cyanobactéries, bactéries vertes/pourpre sulfureuses, etc.
Majoritairement des bacilles
Quelques genres sont des cocci:
Genres Neisseria, Moraxella, & Acinetobacter
10Slide11
Coloration
Acido Résistante
Coloration diagnostique de Mycobactérium
Pathogènes de la Tuberculose et de la Lèpre
Paroi cellulaire avec acide mycoïque
11Slide12
Méthode
Principe:
Contenu élevé de composés similaires aux cires dans la paroi cellulaire,
acide
mycoïque
, rend ces bactéries très imperméables aux colorants
12Slide13
Méthode
(Suite)
La paroi est rendue perméable par la chaleur
Coloration avec de la fuchsine basique
Refroidissement retourne la paroi à son état imperméable
Colorant est piégéLavage avec de l’alcool acide
Étape différentielleMycobactéries
retiennent le colorantAutres bactéries perdent le colorant
13Slide14
Coloration de Spores
Spores:
Cellule bactérienne différentiée
Résistante à la chaleur, la déshydratation, les ultraviolets, et différents traitements chimiques
Typique des bacilles Gram positifs
Genres Bacillus et ClostridiumConditions défavorables induisent la sporogénèse
Différenciation de cellule végétative à l’endospore
14Slide15
Coloration au Vert de Malachite
15
Cellule végétative
Spores
Endospore
Sporangium
Perméabilisation des spores par la chaleur
Coloration primaire au
vert de malachite
Lavage
Contre coloration à la
safranineSlide16
Croissance
Bactérienne
16Slide17
Croissance Bactérienne
Augmentation du nombre de cellules
La bactérie se reproduit par fission binaire
(1
2, 2
4….2
n)Les mesures de la croissance représentent des suivis des changements dans le nombre total de cellules ou de la masse des cellules
17Slide18
Profil de
Croissance
Temps
Inoculation
(Temps= 0
)
Log
10
du
nombre
de cellules
Latence
Exponentiellel
Stationnaire
Mortalité
18Slide19
Phase de Latence ou d’Adaptation
Aucune augmentation dans le nombre ou la masse de cellules
Synthèses de composantes requises pour la croissance dans un milieu donné
Adaptation métabolique
19Slide20
Phase Exponentielle
Développement et division cellulaire à vitesse maximale
Le nombre et la masse cellulaire doublent à des intervalles réguliers
Population en équilibre physiologique et biochimique
Nombre et la masse de cellules augmente par un facteur exponentiel (
2n)n = nombre de division ou de générations
20Slide21
Division Exponentielle
21
2
e
doublement
3
e
doublement
4
e
doublement
N
b
final de
cellules (N)
= nombre initial de
cellules (N
0
)
X (2
n
)
n = nombre de
générations
1
er
doublementSlide22
Paramètres de Croissance Logarithmique
Temps de génération: gTemps requis pour que la densité cellulaire double
g = Δt/n
Constante du taux de croissance: k
Nombre de fois que la densité cellulaire double dans une heure
k = n/Δt (Générations/heures)
22Slide23
Paramètres de Croissance Logarithmique
Taux de croissance: µTaux auquel la densité cellulaire change en fonction du temps
µ = ln2/g (cellules/minute)
Nombre de division : n
Nombre de fois que la densité cellulaire double
N = No (2n)
23Slide24
Calcul
Après 4 h de croissance une culture d’E.coli
passe de 100 cellules à 6.6 X 10
6
cellules
Quel était n pour la période de 4h?Quel est le temps de génération?Quel est
la constante du taux de croissance?
Quel est le taux de croissance?
24Slide25
Calcul
Après 4 h de croissance une culture d’E.coli
passe de 100 cellules à 6.6 X 10
6
cellules
Quel est la constante du taux de croissance?
k = n/Δt; k = 16/4h = 4
Quel est le taux de croissance?µ = ln2/g; µ = ln2/15min.; µ = 0.69/15min.
= 0.046 cellule/min.
25Slide26
Calcul
E. coli
a un temps de génération de 20 minutes. Si vous commencez avec 1 cellule d’
E. coli
combien en aurez-vous après 5 heures?
No:1; t: 300min.; g: 20min.
n= t/g; n= 300/20 = 15
N = No(2n); N = 1 (215);
N= 32768
26Slide27
Paramètres
de Croissance à Partir d’un
Graphique
27
Tous les paramètres de croissance doivent être déterminés à partir de la phase logarithmique! Dans ce cas, entre 40-190 min.Slide28
Lecture d’une Échelle L
ogarithmique
28
Quelle est cette valeur?
10
6
10
7
10
8
10
9
1
2 3 4 5 6
7 8 9Slide29
Déterminer le Temps de Génération
29
Méthode 1:
Choisir deux points qui représentent un doublement du nombre de cellules
Ex. 10 et 20
Déterminer l’écart de temps
Méthode 2:
Choisir n’importe quel deux-points et déterminer les coordonnés. (Nombre de cellule et temps)
Calculer n pour l’écart de temps
Calculer g:
Δ
t/n
gSlide30
Phase Stationnaire
Arrêt de la croissance cellulaire
Population n’est plus en équilibre
Arrêt en raison d’un manque de nutriments, d’oxygène ou à une accumulation excessive de déchets, etc.
Représente le rendement de croissance maximal sous les conditions données
Yg : Masse de microorganismes formés/Masse (g) de substrat consomméYm: Masse de microorganismes formés/mole de substrat consommé
30Slide31
Phase de Mortalité
Perte de viabilité exponentielle en raison d’un manque de nutriments ou d’une exposition prolongée à des déchets
Pas nécessairement une perte de masse
31Slide32
Fermentation
32Slide33
Pourquoi la Fermentation?
Fermentation: Métabolisme énergétique cellulaire fait en absence d’oxygène (anaérobie)
Les levures sont souvent utilisées comme fermenteurs
Elles consomment des sucres pour la libération d'énergie et des sous-produits tels que l'éthanol et du dioxyde de carbone
33Slide34
Composantes
de la Fermentation
La fermentation comporte ...
Substrats - habituellement un sucre
Produit - la substance créée (éthanol)
La fermentation nécessite un organisme qui peut utiliser des substrats en absence d'oxygène
34Slide35
Oxydation du
Glucose en Acide
ou
Éthanol
Glycolyse:Oxydation
partielle du glucose au pyruvateProduction nette de 2 ATP
2 NAD sont réduits au NADHNAD est régénéré par la
fermentationCapteur d’électrons organique
35Slide36
Fermentation
Industrielle
36