DOI101556ABiol582007Suppl1 DIRECTED HOMOLOGOUS RECOMBINATION ID: 291131
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metabolites and proteins of industrial interest. To construct strains for the multitude of purposes, efficientchromosomal target, we systematically investigated the effects of several factors influencing the outcomeof the procedure. Recombinogenic activity was proportional to the length of the targeting homologousmosome had a profound stimulatory effect on recombination of the free DNA ends. These results shedgenome. Taking into account these findings at the assembly of the targeting plasmid con-structs, serial genomic modifications can be created with enhanced efficiency and speed.Keywords: Suicide plasmid, DSB Chi gene replacement RecAorganisms [1, 10, 22, 26]. It is both a prominent model system of basic research and DOI:10.1556/ABiol.58.2007.Suppl.1 DIRECTED HOMOLOGOUS RECOMBINATIONÓSFAIInstitute of Biochemistry, Biological Research Center of the Hungarian Academy of Sciences, *Corresponding author; e-mail: posfaigy@brc.hu &#x ;&#x 1 ;&#x &;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ¶ ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ¼;&#x.Å;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ³ ;&#x °;&#x z;&#x ;&#x o ª;&#x e;&#x § ;&#x Z ¤;&#x P;&#x ¡ ;&#x E ;&#x ;;&#x ;&#x 0 ;&#x %;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ² ;&#x ¯;&#x y;&#x ¬ ;&#x n ©;&#x d;&#x § ;&#x Y ¤;&#x O;&#x ¡ ;&#x D ;&#x :;&#x ;&#x / ;&#x %;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ² ¡;&#x ¯;&#x y;&#x ¬ ;&#x n ©;&#x d;&#x § ;&#x Y ¤;&#x O;&#x ¡ ;&#x D ;&#x :;&#x ;&#x / ;&#x %;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ± ¥;&#x ®;&#x £ y;&#x « ¡;&#x n ©;&#x d;&#x ¦ ;&#x Y £;&#x O;&#x ;&#x D ;&#x :;&#x ;&#x / ;&#x %;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ± ©;&#x ®;&#x § x;&#x « ¤;&#x n ©;&#x ¢ c;&#x ¦ ;&#x Y £;&#x N;&#x ;&#x D ;&#x 9;&#x ;&#x / ;&#x %;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ;&#x ° ¬;&#x ;&#x © x;&#x ª §;&#x n ¨;&#x ¤ c;&#x ¥ ¢;&#x Y ¢;&#x N;&#x ;&#x D ;&#x 9;&#x ;&#x / ;&#x !;&#xǺ!;&#x ;&#x 0;Ǻ Ⱥ ® _ « U ¨ K ¥ A ¡ 7 - " ¸ ~ µ t ² j ® _ « U ¨ K ¥ A ¡ 7 - " · } ´ s ± i ® _ ª T § J ¤ @ ¡ 6 , " ¶ £ } ³ ¡ s ° i _ ª T ¦ J £ @ 6 , " ¶ § } ³ ¥ s ° £ i _ ª T ¦ J £ @ 6 , " µ ª } ² ¨ s ¯ ¥ i ¬ £ _ © T ¦ J £ @ 6 , " µ } ² ª s ¯ ¨ i ¬ ¥ _ © £ T ¦ J £ @ 6 , " µ ° | ² r ¯ ª h ¬ ¨ ^ © ¥ T ¦ ¢ J £ @ 6 , " µ ² | ² ¯ r ¯ ¬ h ¬ © ^ © § T ¦ ¤ J £ ¡ @ 6 , " ´ µ | ± ² r ® ¯ h « ¬ ^ ¨ © T ¥ ¦ J ¢ £ @ 6 , "  y z ¾ y p º z f · z ³ { R ¯ { H « { § | 5 ¤ | + } Ǻ Ⱥ ® _ « U ¨ K ¥ A ¡ 7 - " ¸ ~ µ t ² j ® _ « U ¨ K ¥ A ¡ 7 - " · } ´ s ± i ® _ ª T § J ¤ @ ¡ 6 , " ¶ £ } ³ ¡ s ° i _ ª T ¦ J £ @ 6 , " ¶ § } ³ ¥ s ° £ i _ ª T ¦ J £ @ 6 , " µ ª } ² ¨ s ¯ ¥ i ¬ £ _ © T ¦ J £ @ 6 , " µ } ² ª s ¯ ¨ i ¬ ¥ _ © £ T ¦ J £ @ 6 , " µ ° | ² r ¯ ª h ¬ ¨ ^ © ¥ T ¦ ¢ J £ @ 6 , " µ ² | ² ¯ r ¯ ¬ h ¬ © ^ © § T ¦ ¤ J £ ¡ @ 6 , " ´ µ | ± ² r ® ¯ h « ¬ ^ ¨ © T ¥ ¦ J ¢ £ @ 6 , "  y z ¾ y p º z f · z ³ { R ¯ { H « { § | 5 ¤ | + } Ǻ Ⱥ ® _ « U ¨ K ¥ A ¡ 7 - " ¸ ~ µ t ² j ® _ « U ¨ K ¥ A ¡ 7 - " · } ´ s ± i ® _ ª T § J ¤ @ ¡ 6 , " ¶ £ } ³ ¡ s ° i _ ª T ¦ J £ @ 6 , " ¶ § } ³ ¥ s ° £ i _ ª T ¦ J £ @ 6 , " µ ª } ² ¨ s ¯ ¥ i ¬ £ _ © T ¦ J £ @ 6 , " µ } ² ª s ¯ ¨ i ¬ ¥ _ © £ T ¦ J £ @ 6 , " µ ° | ² r ¯ ª h ¬ ¨ ^ © ¥ T ¦ ¢ J £ @ 6 , " µ ² | ² ¯ r ¯ ¬ h ¬ © ^ © § T ¦ ¤ J £ ¡ @ 6 , " ´ µ | ± ² r ® ¯ h « ¬ ^ ¨ © T ¥ ¦ J ¢ £ @ 6 , "  y z ¾ y p º z f · z ³ { R ¯ { H « { § | 5 ¤ | + } Ǻ Ⱥ ® _ « U ¨ K ¥ A ¡ 7 - " ¸ ~ µ t ² j ® _ « U ¨ K ¥ A ¡ 7 - " · } ´ s ± i ® _ ª T § J ¤ @ ¡ 6 , " ¶ £ } ³ ¡ s ° i _ ª T ¦ J £ @ 6 , " ¶ § } ³ ¥ s ° £ i _ ª T ¦ J £ @ 6 , " µ ª } ² ¨ s ¯ ¥ i ¬ £ _ © T ¦ J £ @ 6 , " µ } ² ª s ¯ ¨ i ¬ ¥ _ © £ T ¦ J £ @ 6 , " µ ° | ² r ¯ ª h ¬ ¨ ^ © ¥ T ¦ ¢ J £ @ 6 , " µ ² | ² ¯ r ¯ ¬ h ¬ © ^ © § T ¦ ¤ J £ ¡ @ 6 , " ´ µ | ± ² r ® ¯ h « ¬ ^ ¨ © T ¥ ¦ J ¢ £ @ 6 , "  y z ¾ y p º z f · z ³ { R ¯ { H « { § | 5 ¤ | + } Ǻ Ⱥ ® _ « U ¨ K ¥ A ¡ 7 - " ¸ ~ µ t ² j ® _ « U ¨ K ¥ A ¡ 7 - " · } ´ s ± i ® _ ª T § J ¤ @ ¡ 6 , " ¶ £ } ³ ¡ s ° i _ ª T ¦ J £ @ 6 , " ¶ § } ³ ¥ s ° £ i _ ª T ¦ J £ @ 6 , " µ ª } ² ¨ s ¯ ¥ i ¬ £ _ © T ¦ J £ @ 6 , " µ } ² ª s ¯ ¨ i ¬ ¥ _ © £ T ¦ J £ @ 6 , " µ ° | ² r ¯ ª h ¬ ¨ ^ © ¥ T ¦ ¢ J £ @ 6 , " µ ² | ² ¯ r ¯ ¬ h ¬ © ^ © § T ¦ ¤ J £ ¡ @ 6 , " ´ µ | ± ² r ® ¯ h « ¬ ^ ¨ © T ¥ ¦ J ¢ £ @ 6 , "  y z ¾ y p º z f · z ³ { R ¯ { H « { § | 5 ¤ | + } Ǻ Ⱥ ® _ « U ¨ K ¥ A ¡ 7 - " ¸ ~ µ t ² j ® _ « U ¨ K ¥ A ¡ 7 - " · } ´ s ± i ® _ ª T § J ¤ @ ¡ 6 , " ¶ £ } ³ ¡ s ° i _ ª T ¦ J £ @ 6 , " ¶ § } ³ ¥ s ° £ i _ ª T ¦ J £ @ 6 , " µ ª } ² ¨ s ¯ ¥ i ¬ £ _ © T ¦ J £ @ 6 , " µ } ² ª s ¯ ¨ i ¬ ¥ _ © £ T ¦ J £ @ 6 , " µ ° | ² r ¯ ª h ¬ ¨ ^ © ¥ T ¦ ¢ J £ @ 6 , " µ ² | ² ¯ r ¯ ¬ h ¬ © ^ © § T ¦ ¤ J £ ¡ @ 6 , " ´ µ | ± ² r ® ¯ h « ¬ ^ ¨ © T ¥ ¦ J ¢ £ @ 6 , "  y z ¾ y p º z f · z ³ { R ¯ { H « { § | 5 ¤ | + } Ncn;&#x{¢;&#x´¾ÄÅ;&#x½²;&#x x ´;&#x ;&#xߺ ;&#x Uaj;&#xu|;&#x ;&#x«¬;&#x;&#xxsh`;&#xSUaj;&#xu|;&#x ;&#x«¬;&#x;&#x ;&#x .;&#xຯ;&#x¦;&#x}vo; 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L» Ý»»L»ä»|»»0ÿ»Ä ½ô¶» ¼°»¸ ¼ ? ? / / кfÀ½f ºfзfºfPºf ÀfpÁf ÃfÄf!»1 À¬»0ÿ»tÔº1» ÀÚ fE»! L» Ý»»L»ä»|»»0ÿ»Ä ½ô¶» ¼°»¸ ¼ ? ? / / кfÀ½f ºfзfºfPºf ÀfpÁf ÃfÄf!»1 À¬»0ÿ»tÔº1» ÀÚ fE»! L» Ý»»L»ä»|»»0ÿ»Ä ½ô¶» ¼°»¸ ¼ ? ? / / кfÀ½f ºfзfºfPºf ÀfpÁf ÃfÄf!»1 À¬»0ÿ»tÔº1» ÀÚ fE»! L» Ý»»L»ä»|»»0ÿ»Ä ½ô¶» ¼°»¸ ¼ ? ? / / кfÀ½f ºfзfºfPºf ÀfpÁf ÃfÄf!»1 À¬»0ÿ»tÔº1» ÀÚ fE»! L» Ý»based gene replacement method is a convenient genome engineering tool. In consecutive recombinationevents, genomic integration of the plasmid, carrying the modified allele, is followed by its excision,resulting in either a modified genome or the original wild-type chromosome. Using the lac operon as achromosomal target, we systematically investigated the effects of several factors influencing the outcomeof the procedure. Recombinogenic activity was proportional to the length of the targeting homologousmosome had a profound stimulatory effect on recombination of the free DNA ends. These results shedgenome. Taking into account these findings at the assembly of the targeting plasmid con-structs, serial genomic modifications can be created with enhanced efficiency and speed.Keywords: Suicide plasmid, DSB Chi gene replacement RecAorganisms [1, 10, 22, 26]. It is both a prominent model system of basic research and DOI:10.1556/ABiol.58.2007.Suppl.1 DIRECTED HOMOLOGOUS RECOMBINATIONÓSFAIInstitute of Biochemistry, Biological Research Center of the Hungarian Academy of Sciences, ÓSFAI Acta Biologica Hungarica 58, 2007 methods is available [4, 5, 9, 11, 14, 16, 24, 29], the demanding task of serial genom-existing procedures. In our laboratory, we have carried out well over a hundred spe-in an extensive genome reduction [13, 21]. We had developed a double strand break had developed a double strand breaksmall, precise genomic surgeries (insertions, point-mutations, deletions, reconstruc-tion of interrupted genes). The multistep procedure involves (i) cloning of a target-plasmid. The last step can proceed in two different ways, resulting in either a modi-fied genome or in reversion to wild-type (wt). Normally, the ratio of wt and mutantproducts is close to 50:50. We hypothesized that, by carefully adjusting factorsaffecting homologous recombination, this ratio can be improved. If conditions favor-frequency [3, 12]. By using targeting fusion fragments composed of two homologoussegments of different length, we intended to channel recombination events largelygely)ated at Chi by losing its exonucleolytic activity. The complex then unwinds the. The complex then unwinds thefrom RecBCD-mediated degradation by properly oriented Chi sites, and showincreased homologous recombination potential [8]. By inserting a Chi site in theproper terminus of the targeting fragment, we planned to stimulate insertion of a cir-cular plasmid in the genome and, subsequently, its excision with a directionalitymeganuclease I-SceI cleavage enhances recombination [7, 17]. We hypothesized thatthe introduction of a properly positioned DSB in the genomic insert allows the cre- MATERIALS AND METHODSTERIALS AND METHODSbased on parent plasmid pSG76-C (YO9893) [19]. Replication of the suicide plas-mids was ensured by using helper plasmid pPIR-A [19]. Meganuclease I-SceI wasexpressed from helper plasmid pSTKST (AF170483) [19]. Standard rich laboratorymedia (LB) and agar plates were used [25]. Antibiotics were used in the followingconcentrations: ampicillin (Ap) 50 g/ml, kanamycin (Kan) 25 g/ml, chloram-phenicol (Cam) 25 g/ml. Chlortetracycline (cTc), inducer of the tet operon, wasc), inducer of the tet operon, washelp of blue-white selection on LB agar plates supplemented with 40 g/ml IPTGand 50 g/ml X-gal.DNA manipulation methodsDNA cloning procedures, chemical transformations and electroporations were doneaccording to standard protocols [15].Deletion constructionConstruction of targeted genomic modifications using suicide plasmids has beendescribed earlier [20]. Briefly, a targeting fragment, composed of two segments,PCR primers. The plasmid is then transformed in the target cell carrying heat-sensi-tive helper plasmid pPIR-A. The helper plasmid provides Pir, required for replicationduced in the integrated plasmid by expressing I-SceI from pSTKST. The DSB is Acta Biologica Hungarica 58, 2007 ÓSFAI Acta Biologica Hungarica 58, 2007 RESULTS chromosomal segments of ~3001000 nucleotides. Replication of both pPIR-A and pSTKST helperplasmids is temperature-sensitive (ori ts). The targeting plasmid carrying an R6K ori requires Pir for S indicates a I-SceI meganuclease cleavage site Individual suicide plasmid constructions used in this study differed only in thelength and sequence composition of the cloned targeting fragments. Directionalitycator plates. (Deletion of this genomic region is known to have no deleterious effectHomologous genomic locations of the targeting fragments and PCR primers areDirectionality of insertion depends on targeting fragment length,nucleotide sequence composition, and presence of Chi sitesoperon. Results are summarized in Table 1. All exper-Without a Chi site (there is no Chi site in the targeted genomic region or in theof recombination events significantly. The stimulating effect of Chi on recombina-distal fragment. Remarkably, the recombination potential depended on the particularfragment in lac55-9 (targeting the the one in lac5-9 (targeting Acta Biologica Hungarica 58, 2007 Homologous genomic locations of the targeting fragments and PCR primers used in the experi- ÓSFAI Acta Biologica Hungarica 58, 2007 Directionality of excision is determined by a complex interplay ofhomologous fragment length, presence of Chi sites, and genomic contextmined. Each experiment was done in duplicates. Results are summarized in Table 2. Without a Chi site, excision was more likely to occur in regions presenting longerhomologous (proximal) region increased markedly. Surprisingly, inserting a Chi sitein reverse orientation in the far end (with respect to the DSB) of the targeting frag-By combining data from Table 1 and Table 2, the overall efficiency of the genomeof the cases, respectively. Table 1Directionality of insertions of various suicide plasmid constructs in the genome of MG1655. Targeting Recombinational genome engineering in 7 Acta Biologica Hungarica 58, 2007 Table 2Ratio of excision of the different insertion types of the suicide plasmid constructs from the MG1665genome resulting in deletions. Targeting fragments are shown with the same shading as in Fig. 2. ÓSFAI Acta Biologica Hungarica 58, 2007 niques, and is the method of choice for small, precise genomic surgeries. However,Effective recombination proceeding via cloned fragments homologous to the tar-geted genomic sites is key to the process. Normally, the cloned fragment consists oftwo segments of equal size, each homologous to different regions of the chromo-excision) can proceed via either segment with similar probability. Enhanced mutantby using unequal-sized targeting fragments, and to force excision via the other seg-related with fragment length. A moderate size-difference of the two fused segments(lac2-5; lac5-9) resulted in a ~2:1 ratio of recombination events favoring the longer ratio of recombination events favoring the longerIn all cases, insertion of a Chi site in the terminal region of the targeting fragmentwith Chi sites present in the genome or in linear exogenous DNA constructs. We. Moreover, in this situation, the stimulating effect was foundbination in the more distant segment. The reason for this is unclear. It is noted, that80% of the Chi sites in the K-12 genome are on the leading strand [2]. It is postulat-ed, that the primary role of Chi is to promote repair of DSBs formed during the repli-cation process [27). We speculate that the slightly aberrant behaviour of the Chi siteMoreover, in the excision process, it participates in intramolecular recombination differently in the excision process and in the natural situation, resulting in the par-tially different effects of Chi. (15%). However, a slight increase might be significant in complex projects requiringdozens of sequential genome modifications. More importantly, in difficult genomeWe wish to thank Agnes Szalkanovics for excellent technical assistance, as well as Tamás Fehér, Zsuzsarfy, Ildikó Karcagi, and Kinga Umenhoffer for helpful comments regarding the experiments. This1.Blattner, F. R., Plunkett, G., III, Bloch, C. A., Perna, N. T., Burland, V., Riley, M., Collado-Vides, J.,Glasner, J. D., Rode, C. K., Mayhew, G. F., Gregor, J., Davis, W. D., Kirkpatrick, H. A., Goeden, M.A., Rose, D. J., Mau, B., Shao, Y. (1997) The complete genome sequence of Science277,2.Burland, V., Plunkett, G., III, Daniels, D. L., Blattner, F. R. (1993) DNA sequence and analysis of136 kilobases of the Escherichia coli genome: organizational symmetry around the origin of replica-3.Court, D. L., Sawitzke, J. A., Thomason, L. C. (2002) Genetic engineering using homologous recom-Annu. Rev. Genet. 36,4.Dabert, P., Smith, G. R. 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