Septiembre, 2018 TEMA: CARACTERIZACIÓN MOLECULAR, DIAGNÓSTICO Y FILOGEOGRAFÍA DEL POTEXVIRUS - PowerPoint Presentation

Septiembre, 2018 TEMA: CARACTERIZACIÓN MOLECULAR, DIAGNÓSTICO Y FILOGEOGRAFÍA DEL POTEXVIRUS CAUSANTE DE SÍNTOMAS DE MOSAICO Y MANCHAS CLORÓTICAS EN PLANTACIONES DE BABACO ( Vasconcellea × heilbornii. var. pentagona) Eduardo Moncayo

INTRODUCCIÓN Virus Fitopatógenos VirusSINTOMAS:Alteraciones en el crecimientoCrecimiento en roseta Manchas cloróticas y mosaicoArrugamiento y deformaciónMuerte de la planta

INTRODUCCIÓNVECTORES ESTACAS SEMILLAS Y POLEN SUELO HERRAMIENTASCONTAMINADAS MECANISMOS DE TRANSMISIÓNDE VIRUS EN PLANTAS

POTEXVIRUSVirión de Potexvirus sin envoltura flexible y filamentosoTamaño:470 a 1000 nm de largo, 12 a 13 nm de diámetroGenoma: ssRNA(+)) entre 5.8 y 7.5 Kb 5 ORFs:replicasa viral triple-gene blockCoat Protein

INTRODUCCIÓNBabaco (Vasconcellea × heilbornii. var. pentagona)Frutal nativo del Ecuador.1500-2500 msnm y 14-20°C.Híbrido natural partenocárpico : Vasconcellea pubescens (Chamburo) x Vasconcellea stipulata (Toronche). Cultivo a nivel de invernaderoReproducción por estacas Crecimiento y Distribución del Babaco en América del Sur. Fuente (Scheldeman, et al . 2011). POTENICIAL DE INDUSTRIALIZACIÓN

Hojas de babaco con sintomatología de virosis Mosaico, Manchas cloróticas, Deformación y arrugamiento     1000 pb750 pb 500 pb   250 pb  169pb   1 2 3 4 5 6 7 8 M PP QP RP C(-) Estudio previo: Identificación del agente causal Especie % Identidad nucleótidos Alternanthera Mosaic Virus 71% Secuenciación y Blast : Criterio de demarcación de potexvirus : <72% de identidad a nivel nt en secuencias de cápside o genes de replicación.

ObjetivosCaracterizar el virus causante de síntomas de mosaico y manchas cloróticas en plantaciones de babaco.Diseñar una prueba de diagnostico viralRealizar un análisis filogeográfico para determinar centro de origen más probable y parámetros evolutivos del virus.

Caracterización Molecular Secuenciación del genoma viral

MetodologíaAnálisis filogenético de PotexvirusAlineamiento múltiple de secuenciasDiseño de primers degenerados Metodología

Metodología Extracción de ARN total a partir de tejido vegetal con sintomatología de virosis Transcripción reversa cDNA PCRCopias de los distintos fragmentos del genoma viralSecuenciación Ensamblaje de contigs a un genoma de referencia Predicción de estructura 3ria proteína CP

Representación del genoma de BabMV. Fuente: (Quinto, et al. 2017)Genoma de referencia: Alternanthera mosaic virus Tamaño de la secuencia consenso obtenida: 4022 ntTamaño final: 6692 nt AMV5 F GCTATAGGTATAGGATTAGC R CCRTCRAAGAAATCRAAVGC AMV6 F AAYGARCTBAGRMTIGAYTGG R AAATAGGGTGTACTTTCCAG cpBMV F GCTGTTTTCTTAGTTATCTAG R GAGGCAAACCTACTCIGG Primer   Secuencia 5´  3’ AMV1 F CCCACTTTCGATGCAAACAC R CCIGIICCIGCIACIGCATG AMV2 F CACCARCAGGCIARRGAYGA R CTCAAACTGCAGCATCGCCCC AMV3 F TAGTGAGCCGCTTGTTGTCC R CGTCVCKGTASSWRCCTCCG AMV4 F AACADRCTIGGRGTBTACTC R CAATTCGCCTTGGGGTTTGAG 96% identidad Resultados: Caracterización molecular del genoma viral

Predicción de estructura terciaria de la proteína de cubiertaEstructura terciaria de la proteína CP: plegamiento con estructuras en forma de hélices alfa (49%), un desorden del 30% y ninguna lamina beta. disposición espacial alargada, flexible y filamentosa.BabMV PepMV El ssRNA se pliega en una hélice de 70 Å de diámetro. Cada CP une cinco ribonucleótidos genoma de PepMV requeriría 1290 copias de PepMV CP que abarca 510 nm. (3,95Å)3.75Å Aumento axial/subunidadHomologo

Morfología de Potexvirus: Estructura flexible, filamentosa, Longitud de 470-1000 nm y 12-13 nm de ancho Fuente: (ViralZone, 2008)BabMV: Partícula larga, filamentosa de aproximadamente ~ 500nm Fuente: (Quinto et al. 2017) 1339 subunidades proteicas para recubrir el genoma de 6692 ntTamaño proteína: 3.75Å Aumento axial/subunidadTamaño inferido: 501nm

Prueba de Diagnóstico para BabMV RT-PCR

Diseño de primers específicos: alineamiento multiple de 15 aislados virales con sus congéneros mas cercanos Extracción de RNA total RT-PCR Diagnóstico mediante RT-PCR. Fragmento del gen codificante de la proteína CP Metodología

ESPECIFICIDAD:Se evaluó la prueba de diagnóstico con 16 aislados virales de babaco de diferentes regiones del país, y dos congéneros controles: PapMV y AltMVSENSIBILIDAD: Cuantificación producto de PCR amplificado por los primers de diagnóstico.diluciones del amplicón hasta una concentraciónAmplicón diluído nuevo template para RT-PCR 210ng/ uL

Resultados: Prueba de diagnóstico para BabMVPrimers  Secuencia 5´ 3’BMVd F TCAGAGTCATCHAACAYTGGAA R TGADGATTCACCAGARATC Especificidad: La prueba de diagnostico fue positiva para aislados virales de distintas provincias del Ecuador, y negativa para dos virus control del mismo genero: AltMV y PMV Sensibilidad: La carga viral mínima detectable de virus fue de 8ng/ uL de cDNA viral Control Potex , PapMV y AltMV

Filogeografía y variabilidad genética de BabMV

Premisas:Distancia genética aumenta con la distancia geográfica Epidemias dejan impronta genómica cuantificable a través del tiempo.Virus de ARN evolución de su genoma ocurre a la par con la dispersión geográfica teoría de coalescencia: dos o más muestras de individuos tomadas en un tiempo (t) convergen en un ancestro en común

Variabilidad genética y Filogeografía de BabMVConsideraciones en el análisis filogeograficoRegión del genoma utilizada: Gen de la proteína de cubierta CPNúmero de muestras: 27 aislados viralesRegiones geográficas: Imbabura, Pichincha, Sto Domingo, Tungurahua, Azuay y Loja HospederosBabaco y ChamburoIntervalo de Fechas de muestreo2016-2018Reloj Molecular Modelo Demográfico Estricto Tamaño constante Crecimiento exponencial Relajado Lognormal Tamaño Constante Crecimiento exponencial Combinaciones de ajuste de Datos genéticos

Árbol de máxima credibilidad y parametros evolutivos de BabMVParametros evolutivosReloj MolecularEstrictoModelo Demográfico Crecimiento exponencialTasa de sustitución 4.81x10-3 Sust/sitio/añoFecha de origen del ancestro en común mas cercano1790 a 1960 (NDC 95%)Genotipos virales3 Región geográfica con mayor variabilidad genéticaTungurahua¿Deriva genética, Selección, Efecto fundador? Proceso Evolutivo:

Distancia genética promedio: 5.4% (0,054)Genotipo mas distante: Genotipo 3, ChamburoCalculo de la distancia genética comparada por pares entre cada aislado de BabMV. En verde se encierran los aislados virales pertenecientes al genotipo 2 y en rojo los aislados virales pertenecientes al genotipo 3. El azul se encierra la distancia genética comparada entre los 3 aislados virales de chamburo pertenecientes al genotipo 3

Ruta de dispersión de BabMV en el EcuadorCentro de origen inferido en el programa: Provincia de CañarLugar mas antiguo de muestreo: Azuay (chamburo) y Sto. Domingo (Babaco)Lugar con mayor variabilidad genética: ImbaburaSalto geográfico: Imbabura-LojaCentro de origen mas probable: Provincia de Loja

ConclusionesSe logro caracterizar el genoma de BabMV el cual consta de cinco ORFs al igual que otros Potexvirus, El ORF1 codifica para la replicasa viral, El ORF2, ORF3 y ORF4 codifican para el bloque triple de genes implicados en la infectividad del virus y el ORF5 codifica para la proteína de cubierta CP.La estructura terciaria de la proteína de cubierta de BabMV contiene 49% de hélices alfa, un desorden del 30% y ninguna lamina beta, lo que le confiere una disposición flexible y alargada homologa al potexvirus Pepino Mosaic Virus. El tamaño calculado de la particula viral fue de 501nmLa RT-PCR diseñada para el diagnóstico de BabMV detectó todos los aislados virales sometidos a prueba y fue capaz de detectar hasta 8 ng/uL de RNA viral. No presentó reacción cruzada con otros potexvirus cercanos. El análisis filogeográfico en conjunto con los eventos de propagación del babaco conocidos en el Ecuador, permitieron inferir que el centro de origen más probable de BabMV está ligado con el centro de origen de su hospedero el cual es la Provincia de Loja y su fecha de origen está entre 1790 y 1960.

RecomendacionesPara los estudios evolutivos de virus fitopatógenos de plantas híbridas de reproducción asexual, se debería tomar en cuenta aislados virales de diferentes hospederos de reproducción sexual, y se debe dar un seguimiento al linaje de estas plantas híbridas y a la procedencia de las líneas clonales.Si bien, los análisis bioinformáticos ayudan a predecir posibles eventos pasados en la evolución de un organismo, hay que tener en cuenta los eventos de migración conocidos para sacar conclusiones acorde a la realidad. se debería incrementar el número de muestras temporales y repetir el análisis filodinámico para reducir la incertidumbre temporal y corroborar los parámetros evolutivos del virus.

AGRADECIMIENTOS Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura Carrera de Ingeniería en BiotecnologíaGrupo de Investigación en Microbiología y Ambiente (GIMA).Francisco Flores, Ph.D. Alma Koch, MSc.Universidad Estatal de Oklahoma, USA. Instituto Nacional de Microbiología Forense y Bioseguridad Agrícola y AlimenticiaFrancisco Ochoa-Corona,  Ph.D . Programa de FruticulturaGranja Experimental TumbacoWilliam Viera, MSc . Andrea Sotomayor, Ing. Proyecto “ Biocontrol for Sustainable Farming Systems , Ecuador " Ministerio de Asuntos Exteriores y Comercio Nueva Zelanda

GRACIAS POR SU ATENCIÓN

Anexos2(Ln K0 – LnK)Fuerza de la evidencia0-2 No significativa 2-6Positiva6-10Fuerte>10 Muy fuerte   Path sampling Stepping-Stone sampling Modelo de coalescencia Ln (k) 2(LnK 0 -LnK) Significancia Ln(k) 2(LnK-LnK 0 ) Significancia Reloj estricto Tamaño constante -2504.742 40 Muy significativo 2504.635 39 Muy significativo Reloj Estricto crecimiento exponencial -2484.813 0 - -2485.101 0 - Reloj relajado Tamaño constante -2508.775 48 Muy significativo -2509.262 48 Muy significativo Reloj relajado tamaño exponencial -2504.047 38 Muy significativo 2504.272 38 Muy significativo Fuerza de evidencia del ajuste de los datos según Kass & Raftery Verosimilitudes marginales y soporte de ajuste del set de datos a un modelo de coalescencia con un reloj molecular estricto y modelo demográfico de crecimiento exponencial