4 eme année pharmacie Dr MorsliM P lan Introduction Structure des acides amines Métabolisme des acides aminés Les pathologies du métabolisme des acides amines Exploration des pathologies du métabolisme des acides amines ID: 934192
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Slide1
L’exploration du métabolisme des acides aminés
4 eme année pharmacie
Dr
Morsli.M
Slide2Plan
IntroductionStructure des acides amines Métabolisme des acides aminés
Les pathologies du métabolisme des acides amines
Exploration des pathologies du métabolisme des acides amines
Slide3Introduction
Les acides amines constituent avec les glucides et les lipides les briques constitutives de la celluleIls proviennent essentiellement de la dégradation des protéines alimentaires ainsi que des protéines endogènes ou bien d’une synthèse de novo
acides amines
Protéines endogènes
Protéines alimentaires
Synthèse de novo
Slide4Introduction
La structure des acides amines leur procure des propriétés physico-chimique qui seront utiles pour leurs mise en évidence pour le diagnostic des aminoacidopathies
, qui sont des pathologies dues à des déficits enzymatiques des voies du métabolisme des acides amines
Slide5structure des acides amines
Les acides amines sont des molécules qui possèdent : une fonction acide carboxylique
Une fonction amine primaire
Une chaine latérale R
COOH
Cette structure leur procure des propriétés physico-chimiques qui sont exploitées pour leur mise en évidence, ils existent des réactions communes à tous les AA qui sont dues au groupement carboxyle et amine, et des réactions spécifiques qui sont dues à la chaine latérale R
CH
R
NH3
Slide6Slide7métabolisme des acides amines
le métabolisme des AA comprend un métabolisme commun a tous qui concerne la fonction amine et la fonction carboxyle , et un métabolisme propre a chaque AA et qui concerne la chaine latérale R
Métabolisme
catabolisme
anabolisme
Synthèse à partir d’intermédiaires métaboliques
Slide8catabolisme
NH3
COOH
R
Décarboxylation
Molécules d’intérêt biologiques
Transamination
D
ésamination
Le catabolisme de l’azote amine
NH3
D
ésamination
Transamination
Oxydative
Non oxydative
Uréogenèse hépatique
Ammoniogenèse rénale
4/5
1
/5
Slide10La transamination
Réaction de transfert réversible de groupement aminé entre un acide aminé et un corps α
cétonique, la réaction est catalysée par une aminotransférase qui utilise le phosphate de pyridoxal comme cofacteur
L’un des couples est toujours le glutamate/
α
cétoglutarate
Slide11Exp : l’alanine aminotransferase
ALANINE NH3 α Cétoglutarate
PLP
PYRUVATE GLUTAMATE
NH3
La désamination
Réaction d’élimination du groupement aminé qui transforme l’acide aminé en son corps
α
cétonique ,la réaction est catalysée par une désaminase
La désamination oxydative:
Catalysée par une glutamate déshydrogénase
GLUTAMATE
α
CéTOGLUTARATE +
NH3
La désamination non oxydative:
Catalysée par une déshydratase , elle concerne les AA suivants:SERINE PYRUVATE +
NH3
THREONINE CETOBUTYRATE + NH3
Slide13La double transamination
La première transamination:Elle est spécifique à l’AA:
AA
NH3
α
CETOGLUTARATE
AC
α CETONIQUE GLUTAMATE
NH3
La deuxième transamination :GLUTAMATE
NH3 pyruvate α
CETOGLUTARATE alanine NH3
GLUTAMATE NH3
OXALOACETATE α CETOGLUTARATE ASPARTATE
NH3
ALAT
ASAT
Slide14La transdésamination
La transamination: catalysée par une aminotransférase
AA
NH3
α
CETOGLUTARATE
AC
α
CETONIQUE GLUTAMATE NH3
La désamination : catalysée par une glutamate déshydrogénase
GLUTAMATE α CéTOGLUTARATE +
NH3
Slide15L’ammoniogenèse
Le NH3 issu de la transdésamination , réagit dans le muscle avec le glutamate pour la synthèse de glutamine, réaction catalysée par la glutamine synthétase
NH3
+glutamate
NH3
glutamine (
2 NH3
)
La glutamine part à destination du rein pour subir 2 désaminations successives catalysée par une glutaminase, et libère le NH4+ qui sera éliminé dans les urines
Slide16L’uréogenèse
NH3+ HCO3-
Carbamoyl phosphate
citrulline
argininosuccinate
arginine
ornithine
asparate
fumarate
urée
1
2
3
4
5
Slide171
Carbamoyl phosphate synthétase2
Ornithine transcarbamylase
3
Argininosuccinate synthétase
4
Argininosuccinase
5
Arginase
Slide18Les pathologies du métabolisme des acides amines
Ce sont des maladies héréditaires qui se transmettent selon le mode autosomique récessif , elles sont dues à des mutations des gènes qui codent pour les enzymes des voies du métabolisme des acides amines
Slide19I . Les déficits génétique du cycle de l’urée
Certaines anomalies congénitales portent sur l’une des enzymes impliquées dans la formation de l’urée , ce qui a pour conséquences une hyperammoniémie car l’uréogenèse est la voie principale d’ élimination du NH3 sous forme d’urée
les symptômes qui se manifestent sont causés par la toxicité de l’ammoniac pour le système nerveux central , il s’agit de nausées , vomissement , trouble du tonus et coma
Slide20Les déficits génétique du cycle de l’urée
PATHOLOGIE
ENZYME DEFICIENTE
SYMPTOMES
HYPERAMMONIEMIE
TYPE I
CARBAMOYL PHOSPHATE SYNTHETASE
LETHARGIE,CONVULSION, MORT
HYPERAMMONIEMIE TYPE IIORNITHINE TRANSCARBAMYLASELETHARGIE,CONVULSION, MORT
ACIDEMIE ARGININOSUCCINIQUE
ARGININOSUCCINASEVOMISSEMENT, CONVULSIONARGININEMIE
ARGINASERETARD MENTAL
Slide21L’uréogenèse
NH3+ HCO3-
Carbamoyl phosphate
citrulline
argininosuccinate
arginine
ornithine
asparate
fumarate
urée
1
2
3
4
5
Slide22II . Les phénylcétonuries
Définition et incidence:
C’est une maladie génétique héréditaire qui se transmet selon le mode autosomique récessif , c’est la plus fréquente des maladies héréditaire du métabolisme des AA ( 1/10000 )
Elle est due à un déficit en
phénylalanine hydroxylase
PAH, ou plus rarement à son cofacteur la tetrahydrobioptérine THB par déficit de la
dihydrobioptérine réductase
,l’enzyme qui permet la régénération de THB
Slide23PHENYLALANINE
TYROSINE
PAH
THB
DHB
DHB REDUCTASE
Slide24b) Clinique:
L’enfant est normal à la naissance , des signes autistiques apparaissent au 6eme mois qui se développent en retard mental due à l’action toxique de la phy sur la myélinisation des nerfs Une hypothyroidie par hypotyrosinémie
Une hypo pigmentation par déficit en mélanine
PHENYLALANINE
TYROSINE
MELANINE
THYROXINE
CATECHOLAMINE
Slide25c) Biologie:
Le déficit en PAH entraine une accumulation de la phy dans le sang , ce qui entraine l’activation d’une voie mineur dans les conditions physiologique qui synthétise les corps cétoniques de la phy qui sont éliminés dans les urines d’où le nom phenylcétonurie
PHENYLALANINE
PHENYLPYRUVATE
PHENYLACETATE
PHENYLLACTATE
Slide26D) Traitement:
Il s’agit d’un régime pauvre en phy, car cette AA reste essentielle à l’organismeUne concentration élevée en phy chez la femme enceinte phenylcétonurique peut provoquer des anomalies du développement du fœtus
Dans les pays développés le dépistage de la PCU est systématique à la naissance
Slide27III Les erreurs innées du métabolisme de la tyrosine
TYROSINE
4-OH PHENYLPYRUVATE
HOMOGENTISATE
MALEYLACETOACETATE
FUMAR
YLACETOACETATE
FUMARA
TE
ACETOACETATE
TYROSINEMIE II
TYROSINEMIE III
TYROSINEMIE I
ALCAPTONURIE
TYROSINE AMINOTRANSFERASE
4OH PHENYLPYRUVATE OXYGENASE
HOMOGENTISATE OXYGENASE
FUMARYL ACETOACETASE
Slide28La tyrosinémie type I:
Due à un déficit en fumarylacetoacetase, ce qui provoque l’accumulation de fumarylacetoacetate qui est à l’origine d’atteintes hépatiques conduisant à des cirrhose , et d’atteintes tubulaires conduisant au syndrome de Fanconi La tyrosinémie type II:
Due à un déficit en tyrosine aminotransferase
,
peut affecter les yeux, la peau et le développement mental. Les premiers symptômes sont le larmoiement excessif, la douleur oculaire et l'apparition d'ulcères à la corné. Une déficience intellectuelle est notée sur 50 % des personnes atteintes.
La tyrosinémie typeIII:
Due à un déficit en 4 OH phenylpyruvate dioxygenase. Elle cause des convulsions, une déficience intellectuelle et, de façon intermittente, une absence de coordination des membres (ataxie).
Slide29L’alcaptonurie:
Due à un déficit en homogentisate dioxygenase qui provoque l’accumulation d’acide homogentisique donnant à la peau une coloration brunâtre, c’est une affection bénigne L’acide homogentisique est incolore mais s’oxyde à l’air libre donnant une coloration brunâtre aux urines
L’albinisme:
Due à un déficit en tyrosinase , l’enzyme qui permet la synthèse de mélanine à partir de tyrosine ce qui induit une perte de pigmentation ( cheveux blanc , peau rose )
TYROSINE
MELANINE
TYROSINASE
Slide30IV La leucinose:
C’est un déficit enzymatique en déshydrogénase des corps cétoniques des acides amines à chaine ramifiée, ce qui provoque l’accumulation de valine, leucine et isoleucine qui seront éliminés dans les urines et lui confèrent une odeur de sirop d’érable
Les signes cliniques sont des vomissements, convulsion et mort précoce
Slide31V. Les hyperhomocysteinémies
Maladie héréditaire transmise selon le mode autosomique récessif, elle est due à un trouble enzymatique du métabolisme de la méthionine .Le défaut enzymatique porte sur la
cystathionine
-synthéase.
METHIONINE
HOMOCYSTEINE
CYSTATHIONINE
cystathionine
-synthéase
.
Slide32Le taux d'
homocysteine sanguin est très augmenté (100 micromole / L au lieu de 10 micromole normalement).
Cette
hyperhomocysteinémie
est responsable d
’
accidents vasculaires, thromboemboliques ou plus rarement d’athérosclérose. L’
homocystéine
a un rôle délétère sur l’endothélium vasculaire, et stimulent la production des médiateurs de l’inflammation
Slide33Tab :les maladies génétiques affectant le métabolisme des acides aminés
LES
PATHOLOGIES
ENZYME DEFICIENTE
SYMPTOMES
BIOLOGIE
HYPERAMMONIEMIE
TYPE ICARBAMOYL PHOSPHATE SYNTHETASE
LETHARGIE,CONVULSION, MORT AMMONIUM
HYPERAMMONIEMIE TYPE IIORNITHINE TRANSCARBAMYLASE
LETHARGIE,CONVULSION, MORT AMMONIUMACIDEMIE ARGININOSUCCINIQUE
ARGININOSUCCINASEVOMISSEMENT,
CONVULSION AMMONIUM , ARGININOSUCCINATE
ARGININEMIEARGINASERETARD MENTAL
AMMONIUM, ARGININEPHENYLCETONURIEPHY HYDROXYLASEDHB REDUCTASE
RETARD MENTAL,
HYPOPIGMENTATION
PHY,
PHENYLACETATE, PHENYLLACTATE, TYROSINE
TYROSINEMIE
I
FUMARYLACETOACETASE
ATTEINTES
HEPATIQUE ET TUBULAIRE
FUMARYLACETOACETATE
ET MALEYLACETOACETATE
ALCAPTONURIE
HOMOGENTISATE DIOXYGENASE
PIGMENTS NOIR SUR LA PEAU
HOMOGENTISATE
LEUCINOSE
DESHYDROGENASE
DES CORPS CETONIQUES DES AA RAMIFIEE
CONVULSION
LEUCINE,VALINE
ET ISOLEUCINE
HYPERHOMOCYSTEINEMIE
CYSTATHIONINE SYNTHETASE
ACCIDENTS THROMBOEMBOLIQUES
HOMOCYSTEINE SANGUIN ET URINAIRE
Slide34Exploration des pathologies du métabolisme des acides amines
L’exploration repose sur la structure chimique des acides aminés qui procure une réactivité aux différents groupements fonctionnelles et permet leurs séparation , identification et quantification dans un milieu biologique
Slide35EXPLORATION
DEPISTAGE
QUANTIFICATION
DOSAGE SPECIFIQUE
FRACTIONNEMENT
Slide36I. Techniques de dépistage:
Ce sont des réactions qui permettent de détecter rapidement une concentration anormale en AA ou en leur catabolites, elles se font sur les urines fraiches du matin
Réaction de BRAND
: permet de mettre en évidence les AA soufrés comme la cysteine et l’homocysteine, qui développent une coloration rouge avec le nitroprussiate de sodium en milieu alcalin
Le 2,4 dinitrophenylhydrazine DNPH
en milieu chlorhydrique donne avec les acides cétoniques un précipité jaune d’hydrazone
Le perchlorure de fer fecl 3
en milieu acide donne une coloration variable selon le dérivé
PHENYLPYRUVATE
VERT ± FUGACE
TYROSINE ET DERIVE
VERT FUGACE
DERIVE DE L’HISTIDINE BLEU VERT STABLE
DERIVE DE LA LEUCINE BLEU
Slide374)
Les ions mercuriques :En présence de nitrites , la tyrosine et ses métabolites donnent un composé rouge violacée
NB:
Le dépistage permet d’orienter le diagnostic
Slide38II. Techniques de quantification des acides amines
Réaction à la ninhydrine
:
Les AA en présence de ninhydrine,à chaud et en milieu tamponné à Ph 5,5 forment un composé violacé appelé pourpre de
ruhemann
dont l’absorbance est mesuré à 570nm
Avec la proline qui est un iminoacide ont obtient une coloration jaune qui absorbe à 440nm
Réaction à la fluorescamine:
La fluorescamine réagit rapidement avec les AA dans un tampon borate PH9 et permet d’obtenir un dérivé fluorescent très sensible qui détecte des concentration de l’ordre du nano gramme
Le chlorure de dansyle
:
Il forme avec les AA un dansylaminoacide
fluorescent Le 1 fluoro 2,4
dinitrobenzene DNFB ( réaction
de Sanger )
À ph 9 les AA forment avec le DNFB le dinitrophenylaminoacide coloré en jaune qui absorbe à 420 nm Rmq:
Ces réactifs réagissent avec le groupement
α
aminé des AA
Slide39III. Technique de fractionnement des acides amines
Chromatographie sur couche mince:
Cette technique permet la séparation des AA entre 2 phases:
Phase stationnaire :la couche de gel en silice ou cellulose
Phase mobile: un solvant qui est un mélange de butanol, d’acide acétique et d’eau
Après migration des AA sur le gel , la révélation se fait à la ninhydrine, on peut identifier l’acide aminé grâce à la comparaison avec des témoins qui sont des standards d’acides aminés
Slide40III. Techniques de fractionnement des acides amines
Electrophorèse sur papier:
Les AA soumis à un tampon acide acquirent une charge qui dépend du groupement fonctionnelle R, cette différence de charge permet leurs séparation par migration lorsqu'ils sont soumis à un champ électrique
Electrochromatographie:
C’est un couplage entre électrophorèse dans une première étape, et une chromatographie dans une étape ultérieur
Cette technique a un excellent pouvoir de résolution
Slide41IV. Techniques de dosage spécifique
Méthodes chromatographiques
Méthodes
microbiolo
giques
Méthodes chi
m
iques
Slide42a) Méthodes chromatographiques :
La chromatographie échangeuse d’ions:
C’est une technique qui permet la séparation, l’identification et la quantification de chaque AA dans un liquide biologique
La colonne de chromatographie est formé d’un tube remplie de particules synthétiques chargées , ceux avec groupements anioniques sont appelés résines échangeuses de cations et ceux qui possèdent des groupements cationiques sont appelés résines échangeuses d’anions
Les AA seront élués en fonction de leur affinité pour la résine
Slide43Exp: colonne échangeuse de cations
Des groupements anioniques sont fixés sur la résine SO3- qui attire les AA chargés positivementLa solution d’acide aminé est amené à ph 3, à ce ph tous les AA sont chargés positivement, cette charge diffère par le radical R
Les AA ayant la charge la plus positive se lie solidement à la résine et migrent plus lentement ,ceux ayant la charge la moins positive migrent rapidement et seront élués les premiers.
Chaque fraction recueillie à la sortie de la colonne est quantifiées par la réaction à la ninhydrine
Slide44Slide45a)Méthodes chromatographiques
La chromatographie liquide haute performance HPLC : C’est une chromatographie à haute pression , la pression permet une séparation en un temps plus court avec une meilleur résolution, l’élution, la collection et l’analyse des fractions sont automatisés , le résultat est un chromatographe qui donne la nature de l’AA par le temps de rétention et sa concentration par la surface du pic . C’est la technique de référence pour l’étude des AA
Slide46b) Méthodes microbiologiques:
Test de Guthrie:La phenylalanine est un facteur essentiel à la croissance de certaines souches de Bacillus subtilus
On additionne à une gélose le B2 thyenylalanine ,c’est un antagoniste de la phy qui inhibe la croissance bactérienne
On étale sur la gélose une suspension de la bactérie et on pose un disque de papier imprégné de sang , si la concentration de la phy dépasse 120 umol/l on aura une croissance bactérienne , la zone de croissance est comparée avec celle obtenues à l’aide de disques témoins
Slide47c) Méthodes chimiques:
Ces méthodes permettent de doser spécifiquement des AA ou des produits de leur métabolisme
Dosage de la
phenylalanine
:
réaction de
McCaman
et Robins
En présence d’un dipeptide L-
leucyl
-L-alanine, la PHY forme un complexe fluorescent avec la ninhydrine
-CuDosage de la tyrosine:
Le 1 nitroso
2 naphtol et le nitrite forment en solution d’acide nitrique avec la tyrosine un complexe fluorescent
Dosage de l’ammoniac:α
Cetoglutarate+NADH,H +NH3 NAD+glutamateOn mesure la diminution de l’absorbance du NADH,H à 340 nm
Glutamate déshydrogénase
Slide48AMINOACIDES
ET DERIVES CONCENTRATION PLASMATIQUE µmol/l
ORNITHINE
45 -
190
ARGININE
20 - 140
VALINE
90 - 290
LEUCINE 70 - 155 ISOLEUCINE
35 - 85 PHENYLALANINE
30 - 70 TYROSINE 25 - 90
Concentrations plasmatiques des acides amines et dérivés